如何选择正确的方法进行细胞的支原体检测?支原体的检测方法有哪些?目前实验室常用的支原体检测方法有培养法、荧光指示细胞法、PCR 法、扫描电子显微镜法,这些方法各有优缺点。各实验室可根据具体情况,选择不同的方法,或几种方法联合使用。
一、培养法
培养法为最为经济可靠的方法,但其实验周期较长,支原体感染做什么检查最准确,所以常用来进行对怀疑细胞的最后甄别。常用于细胞及临床治疗细胞的支原体检查。,
(一)材料与设备
1. 精氨酸肉汤培养基 按说明称量粉剂,蒸馏水配制, 高压除菌(加20%胎牛血清)。2. 支原体琼脂培养基 按说明称量粉剂,蒸馏水配制,高压除菌(加20%胎牛血清)。3. 其他 超净工作台、无菌吸管、试管架、培养试管/皿、37°C 培养箱。
(二)操作步骤
(三)结果判断
培养结束时,精氨酸肉汤培养基如有支原体生长,则液体颜色改变(粉色或黄色) 。半流体培养基中如有支原体生长,则出现絮状沉淀
一、肺炎支原体检查:1、x线检查;2、支原体培养;3、血清抗体测定;4、抗原PCR检测。二、解脲支原体感染检查:1、尿常规;2、尿道或宫颈分泌物涂片检查与支原体培养;3、PCR 检测。
二、荧光指示细胞法
荧光指示细胞法较为快捷,方法简单,但其灵敏度有一定的欠缺, 易造成漏检。
常见的支原体检测方法中最简单、最经济的方法是荧光指示细胞法。该方法使用的荧光染料是烟酸己可碱,其激发波长为350nm(紫外激发),发射波长为420nm。该染料会结合到DNA 中富含A-T 的区域,由于支原体的DNA中A-T 含量占多数(55%~80%),所以可被染色而检测到。支原体污染的细胞经染色后,在细胞核外与细胞周围可看到许多大小均一的荧光小点,即为支原体DNA,证明该细胞有支原体污染。
(一)材料与设备
1. 荧光显微镜。2. CO2 培养箱。3. 无菌小爬片。4. 无菌培养皿。5. 不含抗生素的完全培养液。6. 二苯甲酰胺荧光染料浓缩液(50μg/ml) 。称取5mg 二苯甲酰胺荧光染料加入100ml 不含酚红和碳酸氢钠的Hanks 平衡盐溶液中,在室溫下用磁力搅拌30~40min,使完全溶解,-20℃ 避光保存。7. 二苯甲酰胺荧光染料工作液(0.5μg/ml) 。取1ml 上述浓缩液,加至100ml 无酚红和碳酸氢钠的Hanks 溶液中,终浓度为0.5μg/ml 。8. 固定液,即乙酸:甲醇(1 : 3) 溶液为细胞固定液。9. 封片液。0.1mol/L枸橼酸22.2ml,0.2mol/L Na2HPO4·12H2O 27.8ml,丙三醇50.0ml,以上三者混匀,调pH 至5.5 。10.不含酚红和碳酸氢钠的Hanks 平衡盐溶液或PBS。经多种方法检测确定为支原体阴性的VERO 细胞。
(二)操作步骤1. 无菌收集待测细胞上清:悬浮细胞离心后取上清液。2. VERO 细胞爬片:将小爬片无菌置于小培养皿内,滴加VERO 细胞悬液(细胞浓度约3×104 个/ml) 2~3ml,置于CO2 培养箱内培养24h 使其贴壁。3. 制备标本。向6 孔板内滴加待检细胞上清液约1ml,注意设立对照组(已证实的支原体阳性和阴性细胞上清液),培养48h 后( VERO 细胞汇合前)将细胞爬片从平皿中取出。4. 漂洗—将细胞爬片置于培养皿中,用不含酚红、NaHCO3 的Hanks 溶液(或PBS) 漂洗3次。5. 固定—用乙酸:甲醇(1 : 3) 固定液固定 10 min 。6. 漂洗—待固定液自然风干后用去离子水漂洗3 次。7. 染色—置于Hoechst 33258 工作液(0.5μg/ml) 中染色10 min 。8. 漂洗—去离子水中漂洗3 次,每次1 ~2min 。9. 封片,紫外激发,观察。
(三)结果判断当阴性及阳性对照结果均成立时,结果有效 。1. 阴性结果 仅见待检细胞的细胞核呈现蓝色荧光。2. 阳性结果 荧光显微镜下细胞周围或细胞膜表面可见大小不等、不规则的蓝色荧光小点和丝状点。
(四)小结1. 严格配制工作液及封片液。2. 保证作为指示细胞的VERO 细胞没有被支原体污染。3. 必须同时设立阳性及阴性对照, 注意重复,以排除假阳性和假阴性结果。4. 应全面观察爬片,并注意可疑阳性的荧光点是凋亡小体还是支原体污染。5. 可适当调整荧光染料的工作浓度和染色时间,避免出现非特异性染色,如胞浆着色。
三、PCR 法
PCR 法检测支原体的方法最为快速、灵敏、取样量少,既可做细胞本身,也可做细胞上清的检测,同时可以检测多种支原体的污染,是目前常用的检测手段。但其成本较高,条件要求严格,且有时易出现假阳性或假阴性。弥补的方法是对怀疑的样品要经过3 次PCR 检测,或用培养法检测。
医学检查方法有:x线检查:衣原体肺炎胸片无特异性,多为单侧下叶浸润,表现为节段性肺炎,严重者呈广泛双侧肺炎。沙眼衣原体肺炎胸片显示双侧广泛间质和肺泡浸润,过度充气征比较常见,偶见大叶实变。血常规:周围血白细胞计数。
PCR 法是20 世纪80 年代中期建立起来的一种体外DNA 扩增实验,其基本原理是酶促DNA 合成反应,即在DNA 模板、引物和脱氧核糖核酸存在下,经DNA 聚合酶的作用,使DNA 链扩增延伸。该实验具有灵敏度高、特异性强、检测快速的特点,但其对实验环境要求严格, 实验成本较高, 有时还会出现假阳性的现象。
(一)材料与设备支原体
PCR 检测试剂盒、dNTP 、TaqDNA 聚合酶、缓冲溶液、琼脂糖、矿物油、超净工作台、PCR 仪、电泳仪、凝胶成像分析系统、台式离心机、旋涡混旋器等。
(二)操作步骤
支原体感染也就是非淋菌性尿道炎感染.查白带和尿都可以确诊.关于费用,全国各地的医院收费都有不同.卫生部对非淋菌性尿道炎的实验室检查,也没有规定统一的检验标准。所以无法准确回答。但至少,在现在的情况下,在炎症。
1. 样品的收集。待测细胞用无双抗培养液培养7d,用无菌容器取上清液500μl ,4℃ 保存待测。2. 模板的制作。在无菌的条件下, 取细胞培养上清1 00μl 于一无菌的0.5ml塑料离心管内,盖好盖子, 95 ℃ 水浴加热5min 。3. 打开盖子,向管内加StrataClean Resin 10μl,盖好盖子,旋涡混悬器混合,离心5~ 10s,吸取上清至一新的塑料离心管中,模板制作完毕, 4℃ 保存。4. PCR 反应。反应体系的最适条件为10mmol/L Tris-HCI (pH 8.38),50 mmol/L KCI,1.5~ 2.5 mmol/L MgCl2,200 μmol/L dNTP,2U Taq DNA 聚合酶,总反应体系为50μl , 反应用去离子水均需用紫外灯照射。(1)在0.5ml 塑料离心管中加入35.2μl 去离子水及5μl 10 xTaq 反应缓冲溶液。(2)依次加入下列成分:0.4μl dNTP (25mmol/L)、0.4μl Taq 酶(5U/μl ) 、2μl引物。(3)加2μl 去离子水,总体积45μl 。(4)加5μl 已制成的模板到反应体系中。(5)阳性对照,内对照各5μl 加入到各自的反应体系中。(6)取1支含有以上反应体系的离心管,加入5μl 去离子水作为阴性对照管。(7)在反应体系中加入100μl 矿物油。(8)PCR 程序见下表。
5. 琼脂糖凝胶电泳。PCR 反应结束后,进行琼脂糖凝胶电泳,琼脂糖凝胶浓度为2%。电泳结束后,凝胶成像分析结果。6. 结果分析。该方法为检测支原体的定性方法,在电泳泳道上, Marker、阳性对照、内对照均会出现不同的电泳条带, 当被检样品泳道出现明亮条带,且位置在阳性对照和内对照条带位置之间,即可认为该样品被支原体污染 。有时还会发现一条泳道出现多条,可能是该样品感染2 种以上支原体所致。如果泳道内条带隐约出现,则可怀疑有支原体污染,重做该样品。
(三)注意事项PCR 反应的前期操作应在无菌环境中进行。注意假阳性、假阴性,有时需多次重复。
四、扫描电子显微镜法
扫描电子显微镜法:扫描电子显微镜法非常直观、准确,对使用环境要求高,操作复杂,实验周期较长,常作为样品的最后定性检测。
(一)原理
利用电子显微镜的超级放大功能, 直接观察培养细胞中支原体污染情况。
(二)材料与设备
待检测细胞, 0.05%胰蛋白酶/0.02%EDTA 、2.5%的戊二酸、1%锇酸、0.1mol/L磷酸缓冲溶液( pH7.4 ) ,扫描电镜及相关设备。
1、支原体培养 用无菌棉拭子取女性宫颈的分泌物,放置 支原体选择性培养基中,并将其放在37度的温箱中,若两天内 支原体选择性培养基颜色变为红色则说明 支原体培养阳性,若不变色则 支原体培养阴性。2、间接免疫荧光染色检。
( 三)操作步骤
(四)结果分析